프로바이오틱스는 우리 몸의 장 속에 주로 서식하며 적절한 양으로 투여할 경우, 장내 미생물 균형 개선을 포함하여 일반적인 영양 이상으로 숙주에 건강상의 이익을 부여하는 살아있는 미생물로 알려져 있다(Saarela 등, 2000). 프로바이오틱스가 인체에서 정장작용 및 다양한 생리 활성을 발휘하기 위한 중요한 조건은 위산과 담즙이 존재하는 환경에서 생존력이 높아야 하며, 대장 상피세포에 대해 높은 부착능을 발휘하고, 유해세균을 제어할 수 있는 항균물질 생산능을 갖춰야 한다고 알려져 있다(Garcia 등, 2014). 또한 프로바이오틱스는 돌연변이 유발이나 용혈능이 없어야 하며, 비병원성이며, 바이오제닉 아민 등과 같은 유해물질 생성에 따른 독성 발생 가능성이 낮아야 하는 등 반드시 안전성이 확보되어야 한다(Gueimonde과 salminen, 2006). 이와 더불어, 프로바이오틱 유산균은 항생제의 세포벽, 단백질, 핵산 합성저해, 경쟁적 대사 저해에 대하여 내성을 가져야 하며, 감수성이 높으면 사용할 수 없다고 알려져 있다(Ann, 2011). 이러한 내산성, 내담즙성과 항생제 내성 등을 포함한 프로바이오틱스의 특성들은 미생물의 종류에 따라 그 정도가 다르게 나타나며, 같은 종에 속한 미생물의 경우에도 차이가 있는 것으로 알려져 있다(Gueimonde과 salminen, 2006; Tulumoglu 등, 2013).
따라서 본 연구에서는 한국의 전통음식인 김치에서 분리한 유산균 중 Lactobacillus pentosus A67과 L. plantarum subsp. plantarum C2의 내산성, 내담즙성과 항생제 내성시험을 통해 프로바이오틱스 활성을 확인하여 기능성 프로바이오틱스 소재로서의 활용 가능성을 검토하였다.
본 실험은 서울과 경기 지역의 재래시장과 가정집에서 김치를 수집하여 Bromocresol purple (BCP; Difco, USA) 한천배지를 이용하여, 유산균으로 판단되는 균주를 1차 분리 후, Lactobacilli de Man, Rogosa and Sharpe (MRS; Difco, USA) 한천배지에서 증균하여 본 연구에서 사용하였다. 분리된 균주는 16S rRNA gene sequence 분석을 실시하였으며, 균주의 생화학적, 생리학적 분석을 위해 API 50CHL kit (bioMérieux, France)를 이용한 당 이용성 분석과 API ZYM kit (bioMérieux, France)을 이용한 효소활성 분석을 진행하였다(Francoise 등, 2005).
노란색 환을 형성하는 유산균 colony를 무작위로 선별하여, 한천배지확산법을 통해 항균활성을 확인한 결과, E. coli 에 대한 항균활성이 가장 우수한 분리균 A67과 C2를 프로바이오틱스 활성 평가 균주로 선정하였다. 선별된 균주 A67과 C2의 16S rRNA 염기서열 상동성은 각각 L. pentosus ATCC 8041 (유사성 100%), L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917(유사성 100%)와 가장 유사했다. API 50CHL kit을 이용하여 당 이용성을 분석한 결과, 공통적인 당이용성 이외에 L. pentosus A67은 L. pentosus ATCC 8041보다 inulin, melezitose, α-methyl-D-mannoside, D-turanose, D-arabitol의 이용성을 추가로 보였으나, L. pentosus ATCC 8041가 이용한 glycerol, L-arabinose, D-xylose, galactose는 이용하지 못하였다. L. plantarum C2는 L. plantarum ATCC 14917과 비교하였을 때 glycerol, lactose, rafinose, α-methyl-D-mannoside, D-arabitol의 이용성을 추가로 보였다. API ZYM kit을 이용하여 효소활성을 분석한 결과, 공통적인 활성 이외에 L. pentosus A67은 L. pentosus ATCC 8041보다 alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), lipase (C14), α-galactosidase, β-glucuronidase 효소 활성을 추가로 보였으며, L. plantarum C2는 L. plantarum ATCC 14917보다 alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), lipase (C14), α-galactosidase, β-glucuronidase, trypsin, α-chymotrypsin 효소 활성을 추가로 보였다. 따라서 L. pentosus THK-aA67과 L. plantarum THK-C’2는 각각 L. pentosus ATCC 8041, L. plantarum ATCC 14917과 16S rRNA 염기서열상 유사하나, 당 이용성과 효소 활성에 있어서 차이를 보이므로 표준균주와는 생리학적, 생화학적으로 다른 특성을 보일 것이라 판단된다.
유산균이 체내에 경구적으로 투여되었을 때 소화액과 투여된 항생제로부터 높은 저항성을 가지며, 인체에 유익한 역할을 하는 프로바이오틱스로 활용하기 위하여 프로바이오틱스 특성을 검토하였다. 모든 실험에서 생존율은 생존율(%)으로 산출하였고, 모든 과정은 3회 반복 시험되었다. 유산균의 내산성, 내담즙성 실험 및 항생제 내성시험은 Tulumoglu 등(2013)의 연구방법을 응용하였다. 유산균의 내산성 시험은 인공위액 환경(pH 2.5)을 조성하고, 108 CFU/mL 수준으로 접종하여 관찰하였다. 내담즙성 시험은 인공담즙산 환경(0.3% Bile salts)을 조성하고, 108 CFU/mL 수준으로 접종하여 관찰하였다. 유산균의 항생제 내성시험은 10개의 계열별 항생제를 용해 가능한 최대 고농도 (12.5 mg/mL)에서부터 96 well plate 상에 순차적으로 2배수 희석하고, 유산균을 106 CFU/mL로 접종한 후 지시균주의 생장 여부를 관찰하였다.
내산성 시험결과(Fig. 1), pH 2.5 인공위액상에서 30분까지 L. pentosus A67은 약 98.35%의 생존율을 보였고, L. plantarum C2는 약 95.62%의 생존율을 보였다. 이와 같은 결과는 Tulumoglu 등(2013)의 연구와 비교하였을 때, L. pentosus A67이 내산성이 우수한 L. pentosus T13의 생존율 95%보다 3.35% 더 높은 생존율을 보였으며, L. plantarum C2는 내산성이 우수한 L. plantarum T15의 생존율 92%보다 3.62% 더 높은 생존율을 보였다. 일반적으로 유산균의 내산성은 당분해 과정 흐름 (glycolytic flux)의 변화, 세포 내 pH 조절 능력과 세포막의 ATPase와 관계가 있으며, 식품의 성분에 의해 저항성은 유의하게 증가되는 것으로 보고되어 있다(Radulovic 등 2017). 따라서 L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 세포 내 pH 조절능력 우수하며, 세포막의 ATPase 작용들에 의해 위산에 대하여 높은 저항성을 보이는 것으로 판단된다.
내담즙성 시험 결과 (Fig. 2), 0.3% Bile salt상에서 L. pentosus A67은 30분까지 약 94.56%의 생존율을 보였고, L. plantarum C2는 60분까지 약 88.81%의 생존율을 보였다. 이와 같은 결과는 Tulumoglu 등(2013)의 연구와 비교하였을 때, L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 각각 내담즙성이 우수한 L. pentosus T13(생존율 96%)과 L. plantarum T15(생존율 93%)등과 비교하였을 때, 유사한 생존율을 보였다. 일반적으로 담즙산은 지질로 구성된 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있는데, Lactobacillus속을 포함한 많은 종의 유산균에서는 담즙산염 가수분해효소를 생성하여 담즙산을 가수분해하고, 이 같은 억제작용을 감소시키는 것으로 보고되어 있다(Sahadeva 등, 2011).
항생제 내성시험 결과 (Table 1), L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 quinolone, aminoglycoside, macrolide, glycopeptide, tetracycline, cephalosporin, penicillin 계열에 해당하는 항생제에서 생존하는 것으로 확인되었다. 또한 항진균제로 쓰이는 miconazole과 amphotericin B에 대하여 L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 12500 mg/mL의 고농도에서도 생존하였다. Ampicillin의 MIC는 L. pentosus A67과 L. plantarum C2에 대하여 각각 0.98 mg/mL, 1.95 mg/mL 였으며, L. plantarum C2가 L. pentosus A67보다 streptomycin sulfate와 ampicillin에서 상대적으로 0.98 mg/mL만큼 더 높은 농도에서도 생존하였다. 일부 Lactobacillus 속은 본질적으로 광범위한 항생제에 대한 저항성을 보이는 것으로 알려져 있는데, vancomycin에 대한 저항성은 많은 유산균들의 본질적인 특성이며, chloramphenicol, erythromycin 및 tetracycline에 대한 저항성은 균주에 따라 다양하다고 보고되어 있다(Saarela 등, 2000). Casado 등(2016)의 연구와 비교하였을 때, 우수한 항생제 내성을 가진 L. pentosus MP-10은 L. pentosus A67보다 vancomycin-HCl에서 103.00 mg/mL만큼 더 높은 항생제 농도에서 생존을 보였지만, L. pentosus A67이 L. pentosus MP-10보다 streptomycin sulfate, erythromycin, tetracycline, ampicillin에서 각각 45.31 mg/mL, 31.24 mg/mL, 4.20 mg/mL, 0.78 mg/mL만큼 더 높은 항생제 농도에서 생존함으로써 더 많은 계열의 항생제에서 상대적으로 강한 항생제 내성을 보인다는 것을 확인하였다. 또한 Georgieva 등(2015)의 연구와 비교하였을 때,
우수한 항생제 내성을 가진 L. plantarum 24-2L이 L. plantarum C2보다 vancomycin-HCl과 tetracycline에서 각각 더 높은 농도의 항생제에서 생존하며 내성을 보였지만, L. plantarum C2는 streptomycin sulfate, erythromycin, ampicillin에서 L. plantarum 24-2L보다 366.62 mg/mL, 30.50 mg/mL, 1.57 mg/mL만큼 더 높은 항생제 농도에서 생존함으로써 더 많은 계열의 항생제에서 상대적으로 강한 항생제 내성을 보였다. 특히 Georgieva 등(2015)의 연구에 따르면 L. plantarum,L. casei, L. salivarius, L. leichmannii, L. acidohilus 등은 D-alanine ligase-related enzymes을 가지고 있으므로 약제에 대한 저항성이 큰 것으로 보고되어 있다. 따라서 L. pentosus A67과 L. plantarum C2도 D-alanine ligase-related enzymes에 의해 항생제에 대한 내성을 보인 것으로 사료된다.
이러한 결과로 미루어 볼 때. L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 장내환경에 생존하기 적합하고 같은 종의 균주보다 우수한 내산성능 및 내담즙성능을 가진 프로바이오틱스로 판단되며, 다양한 계열의 항생제에 대한 우수한 내성을 가진 프로바이오틱스로 판단된다. 따라서, L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 다양한 항생제와 병행하여 처방될 수 있고, 장내에서 항생물질을 견딜 수 있으며, 동일한 종의 균주들보다 우수한 항생제 내성을 보유하고 있는 기능성 프로바이오틱스로 판단되며, 추가적인 연구가 요구된다.