김치 유래 유산균의 생리학적 활성

식중독 및 염증유발 균주에 대한 항균활성 평가를 위해 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection (ATCC), USA)과 국립농업과학원 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection (KACC), Korea)에서 식중독과 염증의 원인이 되는 8종의 지시균주 E. coli KCTC 2443, Bacillus cereus ATCC 14579, B. subtilis subsp. spizizenii KCTC 3705, Staphylococcus aureus KACC 10778, Salmonella enterica subsp. enterica KACC 10763, Candida tropicalis var. tropicalis KCTC 17762, C. glabata KCTC 7219, C. albicans KCTC 7270을 분양 받았다. 각각의 균은 최적조건에서 24시간 배양 후 시험에 사용하였다. 또한 L. pentosus ATCC 8041, L. plantarum ATCC 14917은 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection (ATCC), USA)에서 분양 받아 대조군으로 사용하였고, 모든 시험은 3회 반복 수행되었다.

김치 유래 유산균의 항균 활성을 검토하기 위하여 식중독과 염증의 원인이 되는 8종의 지시균주에 대하여 한천배지확산법, 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration; MIC) 시험법 등을 이용하여 항균실험을 수행하였다(Clinic and Laboratory Standards Institute, 2012, Fatima et al., 2012).

또한 김치 유래 유산균의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 자유라디컬 소거능 시험 (Yoon et al., 2014) 및 Superoxide dismutase (SOD) 유사 활성 시험 (Li et al., 2012)을 수행하였으며, 시험균주의 세포증식률에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포주를 이용하여 검토하였다(Moeslinger et al., 2001).

L. pentosus A67과 L. plantarum C2의 배양액을 처리한 한천배지확산법 실험결과(Fig. 1), L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 E. coli, S. enterica, B. cereus, B. subtilis, S. aureus 등 5주의 지시균주에 대해 강한 항균활성을 보였으며, C. albicans, C. glabata, C. tropicalis 등 진균류인 3주의 지시균주에서는 약한 항균활성을 보였다. L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 그람양성 세균보다 그람음성 세균에서 높은 항균활성을 보였으며, 진균류에서의 항균활성은 세균류에 비하여 낮은 결과를 보였다. 또한 L. pentosus A67과 L. plantarum C2의 배양액에서 각 지시균주에 대한 생육저해 최소농도를 확인하였다(Table 1). L. pentosus aA67과 L. plantarum C2의 배양액은 지시균주 8종의 생육을 대조균주 L. pentosus ATCC 8041, L. plantarum ATCC 14917보다 각각 더 효과적으로 저해하였다. 유산균은 박테리오신, 과산화수소 그리고 유기산과 같은 항균물질을 만들어낸다고 보고되어 있다(Douglas et al., 2003). 따라서 본 연구들을 통해 L. pentosus A67과 L. plantarum C2는 우수한 항균물질을 생성하여 항균 효과를 보였고, 박테리오신이 주된 역할을 하였을 것으로 판단된다.

Fig. 1. Anti-microbial activity of L. pentosus A67 and L. plantarum C2 using disc diffusion test. Each of plates showed the size of clear zone after treating supernatant of culture broth for 1 day against various indicators. Left disc, L. pentosus A67; Right disc, L. plantarum C2.

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항산화 활성을 평가하기 위한 DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 자유라디컬 소거능 시험 (Yoon et al., 2014) 및 Superoxide dismutase (SOD) 유사활성 시험 (Li et al., 2012)을 수행하였다. L. pentosus A67과 L. plantarum C2의 DPPH 자유라디컬 소거능 시험 결과(Fig. 2), 가장 높은 활성을 보인 L. pentosus A67 상등액에서의 DPPH 자유라디컬 소거율은 91.33%로, 항산화 물질로 잘 알려진 arbutin 100 µg/mL에서의 항산화 활성 (67.06%)보다 24.27% 높은 활성을 보였으며, L. plantarum C2에서의 DPPH 자유라디컬 소거율은 81.95%로, arbutin 100 µg/mL에서의 항산화 활성 (67.06%) 보다 14.89% 더 높은 활성을 보였다.

Fig. 2. Antioxidation activity of L. pentosus A67 and L. plantarum C2. DHHP assay : (A), (B); Superoxide dismutase (SOD) like activity : (C), (D). (A), Supernatant compared with arbutin; (B), Cell debris compared with arbutin; (C), Supernatant correspond to SOD; (D), Cell debris correspond to SOD; Concentrations of sample were defined as 1, 10, 100 µg/mL of arbutin and 135 and 25 µg/mL by Bradford protein assay. Values are mean±standard deviations (SDs). a, L. pentosus A67; b, L. plantarum C2. ^*p<0.05 indicates significant differences.

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또한. L. plantarum C2의 배양액은 297.22 units, L. plantarum A67의 배양액은 255.56 units의 SOD 활성과 상응하는 항산화 활성을 확인하였다(Fig. 2). 따라서 본 연구들을 통해 항산화 효과가 뛰어난 L. plantarum A67 및 L. plantarum C2의 섭취는 체내 산화적 스트레스에 대항하여 활성산소의 축적을 막는 데 도움을 줄 것으로 판단된다.

시험균주의 세포증식률에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포주를 이용하여 검토하였다 (Moeslinger et al., 2001). 실험결과, L. pentosus A67과 L. plantarum C2의 배양액 처리 후의 세포의 수가 대조군에 비해 각각 유의적으로 증가하였다 (Fig. 3). 배양액과 동일한 농도의 유산균 증균 배지 (MRS)는 세포증식에 영향을 미치지 않았고, 배양액의 증식률은 L. pentosus A67의 배양액(B)과 L. plantarum C2의 배양액(C)에서 각각 173.5%, 143.5%의 결과를 얻었다. 유산균은 면역을 담당하는 세포의 분열 및 증식을 촉진시켜서 면역기능을 활성화시키는 기능(Garcia 등, 2014)을 갖는 것으로 보고되어 있으며, L. pentosus A67과 L. plantarum C2의 배양액이 면역을 담당하는 RAW 264.7 대식세포 (macrophage cell)를 활성화시킨 것으로 사료된다. 또한 유산균 배양액의 안전성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포주를 이용하여 세포독성을 확인하는 MTT 시험을 수행하였다 (Sylvester 등, 2011). 실험결과, L. pentsosus A67의 배양액은 10%에서도 91.03% ± 2.77%의 생존율을 보였고, L. plantarum C2의 배양액에서도 10% 에서 91.78% ± 3.22%의 생존율을 보였다(Figure 3). 따라서 두 유산균 배양액을 10%까지 처리하였음에도 불구하고 대조군과 비교하였을 때 10% 이상의 유의적인 세포독성이 없었으므로 L. pentsosus A67과 L. plantarum C2 배양액의 안전성을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Cell proliferation and cell cytotoxicity by L. pentosus A67 and L. plantarum C2. The results were expressed as percent of proliferation rate and each bar showed the mean ± SD of the three independent experiments repeated. The RAW 264.7 cells were incubated for 24 h in each of samples as calculating increased viable cell from initial seeded 1.5 × cells/well. A-C were diluted by DMEM media. Normal, no treatment; A, supernatant of L. pentosus A67 (100 μg/mL); B, supernatant of L. plantarum C2 (100 μg/mL); C, MRS broth control (100 μg/mL). ^*p<0.05 indicated significant differences. The RAW 264.7 cells were incubated for 24 h in the various concentration of supernatant of L. pentosus A67 and L. plantarum C2. Viable cell numbers, determined using the MTT assay, were represented as the relative percentages (viable cell number obtained from the untreated control cells is 100). Each bar showed the mean±SD of the three independent experiments repeated. Nor, LPS negative; Con, LPS positive; D, culture broth of L. pentosus A67; E, culture broth of L. plantarum C2. ^*p<0.05 indicated significant differences.

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