유산균의 산성환경 적응 메커니즘: Two-Component System(TCS)과 γ-Aminobutyric Acid(GABA) 생산의 연계 가능성

F-ATPase는 F₁ 단백질을 통해 세포 내 ATP를 가수분해 또는 합성할 수 있고, F₀ 복합체를 통해서 양성자를 수송하여 세포질 pH를 조절하는 보편적인 산 저항 경로에 이용된다(Fig. 1). F-ATPase는 산 내성의 중요한 구성 요소이며, 유산균에서 산 저항성이 높아질수록 활성이 증가한다. Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, L. acidophilus, L. rhamnosus, Oenococcus oeni 등의 유산균 종에 F-ATPase가 잘 알려져 있다(Wang et al., 2018b). 낮은 pH 환경에서 L. acidophilus는 F-ATPase를 암호화하는 atp의 전사 수준이 높아졌으며, L. rhamnosus GG의 F-ATPase 유전자 발현을 유도하였다. 산 저항성 균주인 L. casei Lbz-2는 야생형 균주인 L. casei Zhang보다 H⁺-ATPase 활성이 더 높게 나타났다. 그와 동시에 낮은 pH에서 L. casei Zhang보다 더 높은 세포 내 pH를 보여주었다(Koponen et al., 2012; Kullen and Klaenhammer, 1999; Wu et al., 2012). 적응 진화 균주인 Leuconostoc mesenteroides LMS70은 장기간의 젖산 노출을 통해 산 내성 균주로 진화하였다. 전체 유전체 서열 분석을 통해 F-ATPase의 ε subunit을 암호화하는 atpC 유전자의 frameshift 돌연변이를 확인하였고, 이로 인해 산 조건에서 proton pump 활성이 향상되어 산 저항성이 증가한 것으로 보고되었다(Ju et al., 2016).

Fig. 1. Schematic representation of proton pump by F-ATPase of lactic acid bacteria induced under acid environment. F-ATPase is composed of F₁ domain and F₀ domain. F₁ domain, hydrolysis or synthesis of ATP; F₀ domain, proton extrusion.

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아미노산 탈탄산작용(amino acid decarboxylation)은 아미노산 antiporter와 결합하여 양성자의 생화학적 소비를 이끈다(Papadimitriou et al., 2016). 대표적인 예로 GABA는 세포질에서 glutamate의 탈탄산작용을 통해 만들어지며 이 과정에서 세포 내 양성자를 소비하게 된다. 따라서, glutamate decarboxylase(GAD) 시스템은 박테리아의 세포 내 pH 값을 유지할 수 있고 세포의 산 저항성에 중요한 역할을 수행하게 된다(Cui et al., 2020). L. brevis의 GABA 생산을 높이기 위해 GAD를 과발현시킨 F-ATPase 결핍 균주 L. brevis NRA6는 야생형 균주와 비교하여 GABA 전환율과 수율이 증가하였고, 동일한 조건에서 야생형 균주보다 1.22배 더 높았다(Lyu et al., 2017). 이 결과는 F-ATPase와 GAD 시스템이 산성 환경에서 밀접한 상관관계를 가지고 있으며, 가장 잠재력이 있는 산 저항성 시스템으로써 가능성을 보여주었다.

산 스트레스는 세포 표면의 분자적 변화를 야기할 수 있고, 박테리아는 외부 스트레스 반응으로 막 지질 구성을 변화할 수 있다. 세포질 막의 구성은 열에서부터 낮은 pH까지 다양한 스트레스에서 생존하기 위한 프로바이오틱스의 능력을 극대화할 수 있다(Papadimitriou et al., 2016). 산성 적응된 L. casei ATCC 334의 세포질 막 지방산 분석 결과, 대조군에 비해 포화 지방산과 사이클로프로판 지방산의 총 비율이 유의적으로 높게 나타났다(Broadbent et al., 2010). L. johnsonii NCC 533의 경우는 성장 배지에 불포화 지방산을 첨가하여 균주의 열과 산성 내성, 병원성균 저해와 같은 특성을 조사하였고, 막 조성과 형태가 크게 변화하는 것을 확인하였다. 특히, 막 지방산 구성이 포화 수준에서 열 또는 산의 충격 동안 세포 생존의 변화와 관련되어 있었다(Muller et al., 2011). 산 적응 진화를 통해 얻은 L. plantarum의 진화 균주는 전사체 분석과 지방산 측정을 통해 지방산 합성 경로 유전자 발현과 불포화 지방산 생산 증가가 관찰되었고, 이를 통한 세포막 구성의 변화는 수소이온의 유입을 막음으로써 세포 내 pH를 조절하고 산 내성에 기여할 것이라고 보고되었다(Zhu et al., 2024).

미생물의 바이오필름 형성과 물리화학적 변화는 환경 스트레스를 견뎌내는 중요한 생존 전략이 되어왔다. 낮은 pH 환경에 마주했을 때, 막 이동성과 불포화 지방산 비율 그리고 평균 사슬 길이의 증가는 바이오필름의 유동성, 지방산 분포, 세포의 온전함을 변화하여 유산균의 산 저항성을 증가하도록 만든다(Wang et al., 2018b). L. delbrueckii subsp. bulgaricus는 중심 대사 네트워크 유전자들이 피루브산 대사 변경을 통해 지방산 구성의 수정을 유도하여 바이오필름의 이동성에 영향을 주고 낮은 pH 조건을 극복하도록 도와준다고 보고되었다(Fernandez et al., 2008).

산 스트레스에 의한 대사 경로 전환은 중화 과정과 탈탄산작용을 포함한다. 미생물은 산을 중화하기 위해 요소, arginine, 암모니아와 같은 알칼리성 물질을 생산하거나, 대사 과정에서 탈탄산작용을 통해 CO₂를 생산한다. 그 예로 Arginine deiminase system (ADI)과 Malolactic fermentation(MLF) 대사 경로가 있으며, 각자 알칼리성 물질인 암모니아와 탈탄산작용에 의한 CO₂를 생산함으로써 세포 안의 pH 항상성을 유지하게 된다. 야생형 균주 L. casei Zhang과 비교하여, 산 저항성 돌연변이는 산성 환경에서 더 높은 세포 내 aspartate와 arginine 수준을 보여주었으며, arginine 또는 aspartate의 첨가에 의해 산 저항성이 증가하였다. Aspartate는 세포질에서 alanine으로 전환될 때, 탈탄산작용을 통해 양성자를 소비함으로써 산 저항성에 관여하는 것으로 보고되었다(Fig. 2). MLF는 O. oeni, Lactobacillus 속(현재 23개의 새로운 속으로 분류됨), Leuconostoc 속 등의 다양한 유산균에 의해 수행되며, L-lactic acid를 생산하기 위한 L-malate의 탈탄산반응으로 아미노산 탈탄산작용과 같이 양성자를 소비하여 산 스트레스에 대응한다. 그 예로 L. casei ATCC 334의 pH 2.5에서 생존 능력이 malate를 첨가함으로써 향상되었다는 연구 결과가 보고되었다(Wang et al., 2018b). Limosilactobacillus reuteri는 산 스트레스에 대응하기 위해 pH 3.5에서는 ADI 시스템을 사용하고, pH 2.5에서는 GAD 시스템을 활용함으로써 다른 조건의 산성환경에서 상호보완적으로 여러 산 저항 시스템을 사용한다고 보고되었다(Teixeira et al., 2014). Lc. lactis NCDO 2118은 GABA 생산 유산균으로 malate와 arginine 첨가를 통해 효율적인 산성환경의 완화를 통해 생존율이 향상되었다. Arginine과 glutamate를 같이 첨가한 경우에 GABA 생산량이 가장 높았고, arginine, malate, glutamate를 모두 첨가하면 pH 6.5에서 대수성장기에 GABA 생산이 가능하였다. 이와 같이 세 가지 기질의 상호 작용을 통해 ADI와 MLF가 GAD 시스템과 함께 산 저항성에 영향을 준다고 보고하였다(Laroute et al., 2016). 알칼리성 물질의 생산과 탈탄산작용 외에도 L. rhamnosus GG의 경우, 낮은 pH 환경에서 포도당과 같은 발효당의 존재 하에 생존율이 증가할 수 있다고 보고되었는데, 해당과정에서 F-ATPase에 ATP를 제공함으로써 양성자를 배출하고 보호 효과를 낼 수 있다고 추측하였다(Corcoran et al., 2005; Papadimitriou et al., 2016). 이와 같이, 산성 환경 대응을 위한 저항 시스템의 작동은 보편적인 대사 경로의 전환에 의해서도 가능하다.

Fig. 2. Schematic representation of arginine and aspartic acid pathways of lactic acid bacteria induced under acid environment. ADI, arginine deiminase; cOTC, catabolic ornithine transcarbamoylase; CK, carbamate kinase; AspD, aspartic acid decarboxylase; AspT, aspartate-alanine antiporter.

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낮은 pH 환경은 생존을 위한 유산균의 선택을 압박한다. 따라서 세포질 pH가 감소할 때, 유산균은 DNA와 단백질과 같은 주요한 생물학적 분자를 보호하기 위한 메커니즘을 작동한다(Wang et al., 2018b). 산성환경에 적응한 Lc. lactis 세포들이 더 낮은 pH 환경에서도 생존할 수 있는 것은 수소 이온의 세포질 농도와 거기에 의존하여 변화하는 몇몇의 대사물질이 산 스트레스에 대한 보호 단백질 합성을 자극하기 때문이라고 추측하였다. 실제로 환경 조건 변화에 박테리아의 적응은 주로 수많은 스트레스 단백질이 우선적으로 합성되는 유전자 발현의 리모델링을 통해 작동한다고 보고되어왔다(Kim et al., 2014; O’Sullivan and Condon, 1997; Rallu et al., 2000). 비록 유산균의 산 적응에서 그들의 정확한 역할은 완전히 이해되지 않았지만, 몇몇 일반적인 스트레스 단백질들이 산 스트레스를 받은 유산균에서 더 풍부하게 감지되었다. 대표적으로 chaperon 단백질은 기존의 필수 단백질을 산 손상으로부터 보호하는데 이용되며 단백질의 구조적 접힘이나 풀림을 돕는 단백질이다. 그 예로서 DnaK, GrpE, GroEL, GroES, ClpL 등과 열 충격 단백질인 Hsp1, Hsp3, Shsp 등이 있다(Budin-Verneuil et al., 2005; De Angelis and Gobbetti, 2004; Kim et al., 2014; Kwon et al., 2003). Streptococcus mutans는 산성 pH에서 DnaK와 ClpL 단백질의 증가가 보고되었고, Lc. lactis에서는 열과 저온 충격에 clpL 전사가 증가되는 것이 관찰되었다(Len et al., 2004; Martín-Galiano et al., 2005). L. johnsonii는 열 충격으로 증가된 GroESL chaperone이 동결 스트레스에 대한 유의적인 교차 보호를 제공하였다고 보고하였다(Walker et al., 1999). Escherichia coli의 dnaK를 Lc. lactis NZ9000에 도입한 결과, 스트레스 내성을 향상시키고 젖산에 대한 내성도 나타내는 것을 보여주었다(Abdullah-Al-Mahin et al., 2010). Streptococcus thermophilus의 shsp 이형 발현은 Lc. lactis ML23의 산 스트레스 생존율을 더 높이는 결과를 가져왔다(Tian et al., 2012). L. delbrueckii의 위장관 조건에서의 노출은 손상된 단백질의 재접힘과 분해를 촉진하는 chaperone인 clpP, clpE, clpL, clpX 유전자 발현의 증가를 가져왔다(Ferreira et al., 2013).

박테리아는 환경 변화에 생리학적 적응을 위해 TCS를 활용한다. 전형적으로 막 결합 감지기인 histidine protein kinase(HPK)와 효과기인 response regulator(RR)로 구성되는데 HPK는 세포질 막에 고정되어 있으며 환경의 변화를 모니터링하고, 그에 상응하는 세포질 RR은 환경 변화 신호에 반응하여 많은 경우 유전자 발현을 조절한다(O’Connell-Motherway & van Sinderen, 2000) (Fig. 3). 식품 유산균의 TCS에 관한 연구는 quorum sensing 메커니즘 조절, 박테리오신 생산으로 시작하였지만, 이후의 연구들은 TCS가 스트레스 반응, 질소 대사 조절, malate 대사 조절, 그리고 항미생물 펩타이드에 대한 저항성과 같은 다른 생리학적 과정에 참여한다는 것을 보여주었다. 이제까지 유산균의 TCS 연구는 상업적 유산균의 유용한 활용보다 병원성 유산균의 억제를 위한 목적으로 더 연구가 되어왔다(Monedero et al., 2017).

Fig. 3. Two-component system. HPK, histidine protein kinase; RR, response regulator.

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최근 진보된 분자적 기술 발달로 전체 유전체 서열 분석을 통해 다양한 유산균에서 추정되는 TCS가 많이 확인되었고, 관련 유전자들의 삭제 효과 실험은 서로 다른 스트레스에 TCS가 관여한다는 사실을 밝혀냈다. 하지만, 대부분 기존에 밝혀진 다른 박테리아의 TCS를 암호화하는 서열과 새롭게 확인된 유산균 유전체 서열을 비교한 결과물로, 특히 잘 알려진 대장균과 같은 다른 종의 미생물과 유산균 사이의 생물학적 차이점을 고려하면 유산균에는 아직 밝혀지지 않은 TCS가 더 많이 존재할 가능성이 있다(El-Sharoud, 2005). TCS complement는 유산균에서 아주 다양하다. 유전체 크기 또는 생활 방식과 TCS의 양 사이에 명확한 상관관계는 성립될 수 없지만, 일반적으로 가장 큰 유전체를 가지는 종들이 가장 많은 양의 TCS를 암호화한다(Papadimitriou et al., 2016). 유산균의 스트레스 반응에 TCS의 관여는 주로 TCS 결함 돌연변이의 표현형 분석에 근거해왔다. Homologous TCS의 불활성은 종종 서로 다른 표현형을 나타내는데 유전자 서열은 비슷하지만 유산균 종과 균주에 따라 생리학적 역할이 다르게 나타나는 것을 의미한다(Monedero et al., 2017; Papadimitriou et al., 2016). 그럼에도 OmpR/ⅢA 계열로 구성된 TCS가 유산균의 TCS로 암호화된 유전자 중에 71.45%로 가장 풍부하며 모든 균주에 오직 하나만 존재하고, 계통 특이적 유전자 손실에 의해 진화 및 수직 상속되어 유산균의 TCS를 연구하는데 가장 중요한 그룹으로 알려져 있다(Monedero et al., 2017; Zúñiga et al., 2011).

산 저항성과 관련한 TCS는 LisR/LisK, VicK/VicR, PhoR/PhoP 등이 가장 많이 알려져 있으며, 산 스트레스에 반응하여 다양한 변화를 통해 산성환경에 대응한다. LisR/LisK는 Listeria monocytogenes에서 확인된 산 내성에 관여하는 TCS로서 HPK의 삭제는 산성 내성의 성장기 변화를 나타내고, 에탄올에서 성장 능력 향상, 병원성 감소 등의 결과를 나타낸다고 보고하였다(Cotter et al., 1999). S. mutans는 산성 환경의 치아 플라크에서 살아가기 위해 glycosyltransferases (GTFs)를 이용해 바이오필름을 형성하는데 이 효소가 Leu. mesenteroides ATCC 8293의 GTFs와 48%의 유사성을 가지고 있다는 것이 확인되었다. 여기에서 VicK/VicR이 온도 스트레스에 반응하여 GTFs가 존재하는 오페론의 전사를 조절하는데 이용되는 것으로 알려져 Leuconostoc 속의 균주들도 다양한 스트레스에 대한 보호 장벽을 만들기 위한 다당류 생산에 이 조절 경로를 활용할 가능성에 대해서 보고하였다(Vallejo-García et al., 2023). PhoR/PhoP 시스템은 Bacillus subtilis에서 확인되는 인산 제한 반응 조절자로 세포벽 teichoic acid 합성, 세포벽의 구성 변화 및 인 저장 등을 조절한다고 보고하였다(Devine, 2018; Hulett, 1996). 이와 같이 TCS들은 다양한 박테리아에서 여러 스트레스 반응 조절에 이용되기 때문에 유산균의 산성환경 적응 과정에도 유사하게 적용될 가능성을 기대할 수 있고 그 활용에 대해 연구해볼 필요성이 있다.

Leuconostoc 속 유산균은 다양한 발효 식품의 종균으로 사용되는 상업적으로 중요한 유산균이다. 특히 전통 발효 식품인 김치에서는 초기 발효 과정에서 김치의 맛을 좌우하는데 결정적으로 작용한다(Jung et al., 2012). 그러나, 산 스트레스에 대한 감수성 때문에 고밀도 세포 배양이 어려워 상업적인 활용도를 높이기 위해서는 Leuconostoc의 산 내성 메커니즘에 대한 이해가 필요하다(Kim et al., 2014). 최근에 적응 진화가 산 스트레스와 같은 특이적 성장 조건 아래 박테리아의 변화 적응을 유도하고 적합성 향상을 위한 하나의 전략으로 사용되고 있다. Ju 등(2016)은 Leu. mesenteroides ATCC 8293을 1년 동안 젖산에 장기간 노출하여 산 내성을 증가시키는 실험을 통해 산 내성 증가와 돌연변이 형성을 확인하였다. 그 중에 세포 내 pH 조절에 관여한다고 알려진 ATPase ε subunit의 돌연변이가 관찰되었고, 산 내성의 증가에 영향을 주는 것으로 보고되었다. D'Angelo 등(2017)은 Leuconostoc 속에 속하는 29개 균주에 대해 산업적 또는 보존 과정에 존재하는 열, 산, 알칼리, 삼투, 산화 등의 다양한 스트레스 요인의 저항성을 평가하였다. Leu. lactis, Leu. mesenteroides 균주들이 가장 높은 저항성을, Leu. pseudomesenteroides, Leu. citreum 균주들이 가장 낮은 저항성을 나타내었다. 열 적응은 세포 생존을 향상하였고, 산 요인에 대한 교차 저항성을 보여주었다. Leu. carnosum은 스트레스 반응과 관련한 추정 TCS로 6개의 HPK, 7개의 RR이 중심 유전체에 위치해 있었고, 4개의 완전한 TCS는 PhoR/PhoP, VicK/VicR, AgrC/AgrA, CiaH/CiaR과 같은 알려진 조절자들과 유사성을 보여주었다(Candeliere et al., 2021).

L. bulgaricus는 현재 가장 가치 있는 유산균 중에 하나이며 세계적으로 유제품 산업에 널리 사용되고 있다. Quantitative PCR을 활용하여 이들이 산에 적응하는 동안 발현되는 TCS를 확인하였을 때, 2개의 TCS와 2개의 HPK가 유도되었고, 각 TCS의 HPK와 RR을 삭제한 돌연변이 균주가 야생형 균주보다 산 적응이 감소되었다. 이 시스템의 RR 불활성은 비록 상응하는 HPK가 불활성되지 않더라도 산 민감성이 증가하는 결과를 나타내었다(Cui et al., 2012). Wang 등(2018)의 연구에서 L. bulgaricus의 산 적응에 관련되어 있다고 보고한 TCS JN675228(HPK1)/JN675229 (RR1)는 전사 데이터와 단백질 분석을 통해 proton pump 관련 단백질, 스트레스 단백질, 탄수화물 대사, 뉴클레오타이드 생합성, DNA 수리, 전사 및 번역, peptide 수송 및 분해, 그리고 세포벽 생합성 등을 포함하는 많은 경로와 관련되어 있다는 것이 확인되었다. Morel-Deville 등(1998)은 L. sakei의 5개 RR을 불활성하였고 이 중 4개의 돌연변이가 서로 다른 스트레스 조건에서 변화된 반응을 보여주었다. L. acidophilus의 연구는 TCS의 불활성화가 우유에서 산 내성을 감소시켰고 산화를 느리게 했으며, 또 다른 TCS는 담즙 내성과 관련이 있다는 것을 확인하였다(Azcarate-Peril et al., 2005). L. casei BL23의 모든 RR의 조직적인 불활성 실험은 17개 RR 중 3개의 불활성이 서로 다른 스트레스 조건에서 주요한 성장 저해를 나타내는 것을 보여주었다(Alcántara et al., 2011). L. reuteri를 pH 6.8에서 pH 4.0, pH 3.0까지 여러 산성조건에 일시적으로 노출하여 단백질 분석을 실시하였을 때, 운반 및 결합 단백질, 전사/번역, DNA 복제/수리, 뉴클레오타이드 대사 및 아미노산 생합성, 탄소 에너지 대사, pH 항상성, 스트레스 등과 관련한 단백질들의 발현이 유의적으로 변화한다는 것이 관찰되었다(Lee et al., 2008; Lee and Pi, 2010). L. casei Zhang은 pH 2.5에 노출 후에 대조군(pH 6.4)과 단백질체 비교 분석을 통해 탄수화물 이화작용에 관여하는 단백질의 발현이 변화한 것으로 밝혀졌다(Wu et al., 2011). L. plantarum 423은 pH 2.5에 노출된 후에 일반적인 스트레스 반응 단백질, 탄수화물 대사, 피루브산 대사 변화와 라이신 생합성 증가, 산화 스트레스 반응 등이 관찰되었고, 세포벽 및 인지질 생합성, 전사, 번역, 세포 분열에 관여하는 단백질의 현저한 감소가 확인되었다(Heunis et al., 2014). 최근에는 스트레스 내성을 가지고 있어 상업용 와인발효에 많이 이용되고 있는 O. oeni의 TCS를 L. plantarum WCFS1에 삽입하여 산성 스트레스 조건에서 야생형 균주와 비교한 연구가 보고되었다. 유전자 발현의 차이를 비교한 결과, 47개의 유전자가 하향 조절되었는데 열충격 단백질, DNA 손상 복구 관련 유전자가 포함되어 있어 TCS 재조합 균주가 산성 스트레스에서 야생형 균주보다 스트레스에 덜 민감하고 DNA 손상이 적었음을 보여주었다(Zheng et al., 2024).

Lc. lactis MG1363의 산성 내성 돌연변이 연구 결과는 산성환경 적응 과정에서 균주의 일반적인 산성 내성 메커니즘으로 확장될 수 있다고 보고하였다. 어떤 돌연변이 균주들은 pH 항상성을 유지하는 능력에 변화를 겪어 산성 스트레스에 특정하게 영향을 받는다면, 다른 경우에는 돌연변이 균주들이 주로 세포 구성 성분의 보호를 위해 일반적인 스트레스 반응을 나타낸다고 보고하였다. 전자는 glutamate 또는 인산 수송에 영향을 받는 돌연변이로 구성되어 스트레스 반응을 유발하는 대사물의 세포 내 수치 감소와 양성자 흡수 감소의 결과로 산성 내성이 증가하는 것으로 보고되었다. 인산 수송체에 결함이 있는 돌연변이의 높은 산성 내성은 스트레스 반응 유전자를 포함하는 조절 유전자의 유도에 기인할 가능성이 있으며, 낮은 pH가 인산 수송체의 활동을 감소시키는 관찰과 일치하였다(Rallu et al., 2000). Lc. lactis MG1363은 6개의 추정되는 TCS가 확인되었고, 그 중 4개가 pH, 삼투 또는 산화적 조건에 영향을 주는 것으로 보고되었다. TCS 파괴 돌연변이의 특성은 산 민감성/저항성, phosphatase 활성의 변화, 염과 과산화수소 민감성 증가로 야생형 Lc. lactis MG1363과 표현형에 차이점을 가지는 것으로 보고되었다(O’Connell-Motherway & van Sinderen, 2000). Lc. lactis의 gadB 돌연변이 균주와 gadCB 돌연변이 균주는 glutamate가 존재할 때 야생형 균주에 비해 낮은 pH에 더 민감하게 반응하였다. 또한, 배양 pH가 낮아지면 glutamate 존재 하에 gadCB 발현이 증가하는 결과를 통해 Lc. lactis가 생존을 위해 glutamate 의존적 산성 내성 메커니즘을 활용한다고 보고하였다(Sanders et al., 1998).