서 론
유용미생물(probiotics)은 적정량 섭취될 경우 숙주의 건강에 유익한 효과가 나타날 수 있는 살아있는 미생물로 정의되며(Reid, 2016), 이와 같은 정의로 시사되고 있는 바와 같이 섭취 시 기대할 수 있는 건강 기능성과 관련된 연구가 주로 수행되어 왔다(Gill and Guarner, 2004; Kechagia et al., 2013; Kerry et al., 2018). 유용미생물의 효능을 향상시킬 수 있는 전략으로서 미생물의 생장 및 유익한 대사산물의 생산을 유도할 수 있는 영양성분인 프리바이오틱스(prebiotics)나 프로바이오틱스-프리바이오틱스 복합체를 구성하는 신바이오틱스(synbiotics)의 개념이 제시되었고, 유용미생물 구성 성분이나 대사산물을 활용하는 포스트바이오틱스(postbiotics)의 개념으로 그 범위가 확대되었다(Li et al., 2021; Vallianou et al., 2020). 이와 같이 유용미생물이 생장 · 대사하면서 생산되는 다양한 물질만으로도 살아있는 유용미생물(live microorganisms)로부터 기대할 수 있는 건강 기능성을 확보할 수 있다는 사실을 기반으로 균 대사산물에 대한 관심이 증대되어 왔다(Liu et al., 2020; Stanton et al., 2005). 한편 미생물은 생물공정을 통해 다양한 산업 분야에서 고부가가치 소재(효소, 고분자 화합물, 생물전환산물, 바이오연료 등)를 대사산물로부터 확보할 수 있는 새로운 생산원으로 각광받고 있다(Di Donato et al., 2019; Monedero et al., 2010; Pierson and Pierson, 2010). 다만 미생물 대사산물은 일반적으로 해당 균주 자체의 안전성과 생산 목표물질 외 대사산물의 잠재적 위해성에 대한 우려로 인해 산업적 활용을 위해서 목표 물질의 정제 과정이 요구되나, 유용미생물이 생산원인 경우 미생물 및 배양액의 안전성을 입증할 수 있는 근거 자료들이 기 확보된 경우가 많기 때문에 정제된 단일 물질뿐만 아니라, 배양액 또한 동 목적으로 활용될 수 있다(Geraldo et al., 2020; Pfefferle et al., 2013; Żółkiewicz et al., 2020). 이에 세포 배양 상등액, 세포 용해물(cell lysates), 틴달화(tyndallization) 처리 배양액, 발효물(ferments) 등을 이용한 유용미생물 관련 효능 확보 기술이 지속적으로 개발 및 상업화되고 있다(Sfriso et al., 2020).
유용미생물이 생산하는 대사산물은 주로 장내 면역 개선 기능성을 목적으로 이용되어 왔으나(Liu et al., 2020), 유용미생물이 장내에서 기타 병원성균의 생장을 저해(antagonistic effects)하면서 경쟁할 수 있는 주요한 원리 중 하나로 밝혀진 세포외 분비(extracellular secretion)가 가능한 항균성분의 활용성이 보고된 바 있다(Wan et al., 2019). 이에 박테리오신을 중심으로 한 유용미생물 유래 항균 기능성 대사산물이 식중독균을 포함한 병원성미생물 제어를 목적으로 활용되어 왔다(Liévin-Le Moal and Servin, 2014; Yang et al., 2014). 항균 기능성 물질은 식품의 생산 · 가공 · 유통 환경 중 오염 가능한 병원성 · 부패미생물 등의 제어에 있어 필수적으로 사용되어야 하나(Costello et al., 2003; Faille et al., 2018), 화학적 합성 살균제 · 보존제에 대한 소비자의 거부감, 기존에 사용되고 있는 항균 유효성분에 대한 내성을 보유한 신 · 변종 미생물의 출현 등의 문제로 천연 유래의 신규 항균 물질에 대한 탐색이 요구된다(Chung et al., 2018; Park and Kang, 2021). 이에 유용미생물로부터 생산되는 항균 기능성 물질은 식품 분야에서의 미생물학적 품질 및 안전성 확보를 위한 전략으로서의 가치가 높다고 할 수 있다.
유용미생물이 생산하는 항균성분에 대한 연구는 주로 특정 유용균주와 제어 대상균의 동시배양 또는 대사산물의 제어 대상균 직접 노출 처리를 통한 생장 저해 또는 살균 등 실질적인 효과를 분석하는 방식으로 수행되어 왔다(Goh et al., 2021; Kavitha et al., 2020; Tebyanian et al., 2017). 한편, 항균성분의 생산 · 조절과 관련된 유용미생물의 유전학적인 특성 분석은 해당 대사물에 의해 기대할 수 있는 항균 활성 스펙트럼과 효능 수준과 관련된 기반 정보를 제공할 수 있으며, 특히 차세대염기서열분석기술(next-generation sequencing technology)의 발전 및 안정화로 인해 특정 균주가 보유한 유전자 전체의 정보를 분석하는 전장유전체를 기반으로 한 항균 특성 연구가 식품 미생물 분야에서도 최근 활발하게 수행되고 있다(Siegert, 2013). 이에 본 총설논문에서는 식품매개질병 및 식품 품질 저하 원인 미생물의 제어에 활용될 수 있는 유용미생물의 항균 물질 특성 관련 연구 현황과 항균능에 대한 이해 확장을 목적으로 유전체 분석법이 활용되고 있는 대표적인 사례를 종합적으로 분석함으로써 해당 연구 분야의 발전 방향에 대하여 고찰하고자 한다.
본 론
유용미생물을 이용한 식품매개질병 원인균 제어 연구는 유용미생물이 생장할 수 있는 영양분이 제공되는 일반적인 환경에서 생산되는 물질의 효과 분석(Table 1)과 특정 식품 내 유용미생물의 생장 · 대사 과정을 통해 확보된 발효물의 효과 분석(Table 2)으로 그 유형을 구분할 수 있다.
Category | Major probiotics strain1) | Major results and implications | Reference |
---|---|---|---|
Probiotics capable of the inhibition of bacterial growth | Lactobacillus bulgaricus PTCC 1332, Lactobacillus casei PTCC 1608, Lactobacillus plantarum PTCC 1058, Lactobacillus fermentum PTCC 1638 |
- Assessment of the inhibitory activity of LAB2) against pathogens ‣ Escherichia coli, Salmonella paratyphi A, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus |
Tebyanian et al. (2017) |
Lactobacillus sp. LBbb0141, Leuconostoc sp. LBdc0103 |
- Isolation of LAB2) from food materials - Identification of LAB with inhibitory activity against representative Gram-positive (G+) and Gram-negative (G-) pathogens ‣ G+: Bacillus megaterium, Listeria ivanovii, S. aureus, Streptococcus sp. ‣ G-: Clostridium sp., E. coli, Pseudomonas sp., Salmonella paratyphimurium B, Salmonella typhimurium - Maintenance of the inhibitory activities under broad range of conditions (temperature, pH) |
Djadouni and Kihal (2012) | |
L. fermentum LABS1, Enterococcus durans LABS2 |
- Isolation of LAB2) from pickled fruits - Identification of LAB with inhibitory activity against representative G+ and G- pathogens ‣ G+: Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, S. aureus ‣ G-: Cronobacter muytjensii, E. coli, Salmonella enterica serovar Poona, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Vibrio parahaemolyticus |
Mohamad et al. (2022) | |
L. plantarum 105/106/1073) | - Isolation of LAB2) from food materials - Strain-dependent inhibitory activity against pathogens ‣ L. monocytogenes, E. coli O157:H7 |
Arena et al. (2016) | |
Cell-free culture supernatant (CFS) produced by probiotics | Pediococcus acidilactici TN1, Lactobacillus farciminis TY1 |
- Isolation of LAB from fermented foods - Assessment of inhibitory activity of CFS against L. monocytogenes |
Jawan et al. (2019) |
Lactobacillus pentosus A6 Weissella paramesenteroides B5/B103, Enterococcus sp. P1b/H4b/B3b/A2b3) |
- Isolation of LAB2) from stingless bees - Assessment of inhibitory activity of CFS against pathogens ‣ E. coli, L. monocytogenes, S. enterica ‣ Clues for the mechanism of the inhibitory activity as the production of bacteriocin due to the limited spectrum of the antibacterial activity against L. monocytogenes |
Goh et al. (2021) | |
P. acidilactici strain CSI29MX, Pediococcus parvulus strain MF233, Pediococcus pentosaceus strain QN1D |
- Isolation of Pediococcus sp. strains from Idli batter - Assessment of the inhibitory activity of CFS against causative agents foodborne diseases and spoilage - S. aureus, E. coli. Salmonella typhi. B. cereus, Pseudomonas aeruginosa |
Khandare and Patil (2015) | |
L. casei, Lactobacillus delbrueckii, L. fermentum, L. pentosus, L. plantarum |
- Isolation of LAB2) from curd and human milk - Assessment of inhibitory activity of CFS against pathogens ‣ B. cereus, E. coli, Klebsiella pneumoniae, L. monocytogenes, S. enterica serovar Typhi, Shigella flexneri, S. aureus - Strain-dependent inhibitory effects according to the bacterial species of target pathogens |
Sharma et al. (2017) | |
Lactobacillus acidophilus L-1, L. brevis 1, L. bulgaricus 6, L. fermentum 1, Lactobacillus helveticus N11/33), L. plantarum 24-2L/24-4B/24-5D3), Bifidobacterium animalis subsp. lactis L-3 |
- Assessment of inhibitory activity of CFS against pathogens ‣ B. cereus, E. coli, S. aureus - Evaluation of the active antibacterial substances as acids by using neutralized CFS - Strain-dependent inhibitory effects according to the bacterial species of target pathogens - Maintenance of inhibitory activity was observed from neutralized CFS from some strains, highlighting the presence of bioactive antibacterial agents other than acids |
Georgieva et al. (2015) | |
Cell-free culture supernatant (CFS) produced by probiotics | L. bulgaricus PTCC 1332, L. casei PTCC 1608, L. fermentum PTCC 1638, L. plantarum PTCC 1058 |
- Evaluation of the active antibacterial substances as acids by using neutralized CFS - Inhibitory activity was also observed after the neutralization of CFS, highlighting the major antibacterial mechanism as other active substances (e.g. H2O2, bacteriocin, etc.) than acids |
Tebyanian et al. (2017) |
L. fermentum LABS1, E. durans LABS2 |
- Evaluation of the active antibacterial substances as acids, H2O2, and bacteriocin by using neutralized, catalase-treated, and trypsin-treated CFS, respectively - Loss of inhibitory activity was observed from only neutralized CFS, highlighting the major antibacterial mechanism as acids |
Mohamad et al. (2022) | |
L. fermentum S1/S2/S8/S163), L. plantarum S17, Lactobacillus rhamnosus S19, Lactobacillus paracasei S14 |
- Isolation of LAB2) from infant feces - Assessment of inhibitory activity of CFS against pathogens ‣ ETEC, S. flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica - Evaluation of the active antibacterial substances as acids and H2O2 by using neutralized and catalase-treated CFS, respectively - Loss of inhibitory activity was observed from both neutralized and catalase-treated CFS, highlighting the major antibacterial mechanism as acids and H2O2, not from bacteriocin or bacteriocin-like compounds |
Davoodabadi et al. (2015) | |
Purified antibacterial agents produced by probiotics | L. plantarum KJB23 | - Production of compound with antibacterial activity (3,4,5,8-tetrahydroxyhexahydro-2H-pyrano[2,3-d][1,2]dioxin-2-one) against L. monocytogenes - Stability and the expected antibacterial mechanisms were investigated. |
Kavitha et al. (2020) |
L. paracasei ZFM54 | - Production of bacteriocin with antibacterial activity against foodborne pathogens ‣ S. typhimurium, L. monocytogenes, Micrococcus luteus - Stability of bacteriocin was investigated. |
Ye et al. (2021) | |
Lactobacillus coryniformis MXJ | - Production of bacteriocin with antibacterial activity against antibiotic- resistant bacterial foodborne pathogens ‣ Cronobacter sakazakii, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella sp., S. aureus - Stability of bacteriocin was investigated. |
Xin et al. (2014) | |
L. helveticus, L. plantarum |
- Production of bacteriocin with antibacterial activity against antibiotic-resistant G+ and G- bacterial foodborne pathogens ‣ G+: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, MRSA4), Streptococcus pyogenes, S. aureus ‣ G-: Acinetobacter baumannii, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. paratyphi A - Stability and the expected antibacterial mechanisms of bacteriocin were investigated. |
Hassan et al. (2020) | |
L. acidophilus NCFM, Lactobacillus crispatus JCM 5810, Lactobacillus gallinarum ATCC 33199, L. helveticus CNRZ32 |
- Assessment of the ability of LAB2) to produce lactic acid sufficient for the inhibition and inactivation of Campylobacter jejuni - Expected antibacterial mechanisms were investigated. |
Neal-McKinney et al. (2012) |
Food source | Major probiotics strain1) | Major results and implications | Reference |
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Cheese | Lactobacillus plantarum NCDC 012, Lactobacillus casei NCDC 297, Lactobacillus brevis NCDC 021 |
- Assessment of inhibitory activity of water-soluble extract against pathogens ‣ Enterococci faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus - Increase of the antibacterial activity of the cheese by the addition of probiotics due to the peptides generated by proteolytic enzymes secreted by probiotics during fermentation. |
Mushtaq et al. (2019) |
Skim milk | Lactobacillus acidophilus L-1, L. brevis 1, Lactobacillus bulgaricus 6, Lactobacillus helveticus N11/32), Lactobacillus fermentum 1, L. plantarum 24-2L/24-4В/24-5D2), Bifidobacterium animalis subsp. lactis L-3 |
- Assessment of inhibitory activity of whey (cell-free whey fractions; CFW) against ‣ Bacillus cereus, E. coli, S. aureus - Strain-dependent inhibitory effects according to the bacterial species of target pathogens - Maintenance of inhibitory activity was observed from neutralized CFW from some strains, highlighting the presence of bioactive antibacterial agents other than acids |
Georgieva et al. (2015) |
Sweet lemon juice | L. plantarum LS5 | - Assessment of inhibitory activity of cell-free culture supernatant from fermented sweet lemon juice against pathogens ‣ E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium |
Hashemi, Khaneghah, et al. (2017) |
Sarshir (kaymak) | L. plantarum LP3/AF1/LU52) | - Assessment of inhibitory activity against Gram positive (G+) and Gram negative (G-) pathogens ‣ G-: E. coli O157:H7, Pseudomonas aeruginosa ‣ G+: B. cereus, S. aureus - Higher inhibitory activity against G+ than G- highlighted the major mechanism as the production of bacteriocin |
Hashemi, Mousavi Khaneghah, et al. (2017) |
Aloe | L. plantarum HM218749. 1 | - Assessment of inhibitory activity of cell-free culture supernatant from fermented aloe ‣ E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, S. aureus - Additional ingredients (e.g. prebiotics) used during the fermentation could contribute to the antibacterial activity |
Jiang et al. (2016) |
Table 1에 나타난 바와 같이 유용미생물의 항균능 분석 연구의 대상은 [동시배양 기반 유용미생물의 타 미생물 제어능—무세포상등액(Cell-free culture supernatant; CFS)의 항균능—미생물로부터 분리 · 정제된 특정 항균 유효성분의 항균능]과 같이 주요 항균물질에 대한 정제 수준에 따라 구분할 수 있다.
먼저 동시배양 기반 유용미생물의 타 미생물 제어능 분석의 경우, 해당 미생물과 제어 대상 병원성균을 고체배지 상에서 동시배양 시 생장 저해가 나타나는 수준에 따라 그 효과를 입증할 수 있다. Lactobacillus 속에 포함되는 다양한 균종(Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum)의 대표적인 식중독균 대상 효과는 대표적인 유용미생물의 항균능 연구 사례로 다수 보고된 바 있다(Tebyanian et al., 2017). Djadouni와 Kihal(2012)의 연구에서는 다양한 식품 원료 및 부산물(유제품, 육제품, 농산물 등)에서 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)을 분리한 뒤 그람음성 및 그람양성 지표균을 대상으로 한 생장 억제 효과를 입증하였으며, 특히 pH 및 생산 온도 등 해당 미생물이 노출될 수 있는 환경을 고려하였을 때 다양한 조건에서 안정적인 효능 스펙트럼을 나타내는 미생물로 Lactobacillus 및 Leuconostoc 속에 속하는 균주를 제안하고, 최대 활성이 나타날 수 있는 조건을 제시하였다. Mohamad 등(2022)의 연구 역시 다양한 종류의 그람음성 및 그람양성 지표균을 대상으로 생장 저해 효과를 나타내는 LAB 균주(Lactobacillus 속 및 Enterococcus 속)를 절인 과일류에서 분리 · 동정하여 다양한 속의 LAB가 주요 병원성균들에 대한 광범위한 제어능을 보유하고 있음을 시사하였다. 다만 L. plantarum 균종에 해당하는 3가지 균주의 그람양성(Listeria monocytogenes) 및 그람음성(Escherichia coli O157:H7) 균 생장 저해능을 평가한 Arena 등(2016)의 연구를 통해서 시사된 바와 같이 동 균종에 속하는 균주에 따라서도 효능을 나타내는 제어 대상 균종이 상이하기 때문에, 유용미생물의 항균능은 속 또는 종 특이적인 현상보다는 균주특이적 특성으로 이해해야 한다.
유용미생물과 제어 대상 미생물 간 동시 배양을 기반으로 한 항균 스크리닝 연구는 생장 제어능을 보유한 미생물을 선별하는 과정에 활용될 수 있으나, 해당 효과가 나타나는 원인을 파악하기 위해서는 유용미생물이 생산한 항균 기능성 물질의 분석이 가능한 CFS의 항균능 평가가 수행되어야 한다. L. monocytogenes는 LAB를 중심으로 한 유용미생물에 의해 효율적으로 제어될 수 있는 대표적인 식중독균 중 하나로, 유용미생물에 의한 박테리오신 생산이 항균능의 주요 기작으로 알려져 있다(Jawan et al., 2019). Goh 등(2021)의 연구에서는 Lactobacillus pentosus, Weissella paramesenteroides, Enterococcus sp.와 같은 LAB를 이용하여 다양한 식중독균(L. monocytogenes, E. coli, Salmonella enterica)의 생장 제어 가능성을 평가하였으나 L. monocytogenes에 대해서만 효능이 나타났다는 결과를 기반으로 박테리오신 생산이 주요한 항균 기작임을 시사하기도 하였다. 다만 L. monocytogenes 외에도 넓은 범위의 항균 스펙트럼을 나타낼 수 있는 유용미생물 및 CFS의 발굴을 위하여 식중독 및 식품 부패 원인균에 대한 효능 분석이 수행된 바 있다(Khandare and Patil, 2015). 특히 다양한 Lactobacillus 속의 균종(L. casei, Lactobacillus delbrueckii, L. fermentum, L. pentosus, L. plantarum)에 해당하는 식품분리균주(커드 및 모유)로부터 확보한 CFS의 항균능 평가 연구 결과에 따르면 제어 가능 균종 분포가 균주특이적이라는 점과 그람양성균 · 그람음성균 모두에 대한 효과(e.g. Bacillus cereus, S. enterica, Shigella flexneri)가 나타날 수 있음을 밝힘으로써 박테리오신 외 CFS를 구성하는 항균 기능 후보물질(e.g. 유기산, 지방산, 기타 박테리오신 외 항균능 보유 대사물질)에 대한 추가적인 분석 필요성이 강조되었다(Sharma 등, 2017). 박테리오신을 포함한 유용미생물이 생산할 수 있는 대표적인 항균 유효성분은 유기산 및 H2O2로 알려져 있으며, 유용미생물로부터 분리한 CFS의 유효성분별 불활성화 처리를 통해 각 유효성분의 항균 활성 기여 정도를 판단하는 연구가 보고되어 왔다(Davoodabadi et al., 2015; Georgieva et al., 2015; Mohamad et al., 2022; Tebyanian et al., 2017). 식중독균 제어능을 보유한 Lactobacillus 및 Bifidobacterium 균주로부터 확보한 CFS와 중화 처리된 CFS의 병원성균(Staphylococcus aureus, E. coli, B. cereus) 생장 저해능을 비교한 Georgieva 등(2015)의 연구 결과에 따르면 중화 이후에도 CFS의 효과가 유지되는 일부 균주가 확보될 수 있었고, 이는 CFS 내에 산 외에도 항균성분이 생산되었을 가능성과 pH 저하 외 항균 기작의 존재를 시사하였다. Tebyanian 등(2017)의 연구 또한 neutralized CFS의 식중독균 생장 제어 효과가 유용미생물과 제어 대상균 간 동시배양을 통해 확인된 효과와 동 수준임을 확인함으로써 항균 기작이 산 생산에 의한 pH 저하가 아닌 기타 항균성분(e.g. H2O2, 박테리오신)의 생산일 수 있다는 가능성을 검증하였다. 다만 pH가 조정된 neutralized CFS, H2O2이 불활성화된 catalase-treated CFS, 박테리오신이 불활성화된 trypsin-treated CFS를 이용하여 주요 병원성 그람양성균 · 그람음성균 제어능을 분석한 Mohamad 등(2022)의 연구에서는 중화된 CFS의 한하여 항균 효과가 소실되었으며, 유기산의 존재로 인한 CFS의 산성 조건이 항균 활성에 기여하는 한편, H2O2 또는 박테리오신의 경우 생산되지 않거나 충분한 항균능을 나타내지 못하는 경우도 존재할 수 있음이 제시되었다. 반면 모유수유 유아의 분변에서 분리된 Lactobacillus 균주의 장 병원성균(e.g. Enterotoxigenic E. coli, S. flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica) 생장 제어 연구에서는 유기산 또는 과산화수소의 생성을 주요한 기작으로 추정하는 한편 neutralized CFS뿐만 아니라, catalase-treated CFS의 무처리 CFS 대비 항균 효과 감소가 나타나 박테리오신 또는 박테리오신 유사물질(bacteriocin-like compounds)에 의한 항균 효과는 미미하거나 없는 것으로 추정하였다(Davoodabadi et al., 2015).
CFS의 경우 미생물의 생장 과정에서 생산된 다양한 대사산물의 복합체이기 때문에 특정 항균유효성분의 불활성화(neutralized, catalase-treated, trypsin-treated CFS)를 기반으로 단일 성분별 항균능 기여 여부를 유추할 수는 있으나, 특정 항균유효성분의 효능 검증을 위해서는 추가적인 정제가 요구된다. 일반적으로 유용미생물이 생산하는 항균물질의 스크리닝을 통해 기존에 대상 식중독균에 대한 효능이 보고된 바 없는 소재를 신규 발굴하는 것을 목적으로 하는 연구가 보고되고 있으며, 분리정제 후 구조 및 기작 분석과 함께 독성 분석을 진행하여 활용성을 검증할 수 있다(Kavitha et al., 2020). 유용미생물이 생산할 수 있는 주요 항균 유효성분의 분리는 특히 박테리오신을 중심으로 한 연구가 진행되어 왔으며 식품(Mokoena et al., 2021), 바이오필름(Pang et al., 2022; Pérez- Ibarreche et al., 2016), 표면(Camargo et al., 2018b) 등을 대상으로 한 박테리오신의 활용 가능성이 보고되어왔다. 박테리오신의 효과는 L. monocytogenes를 중심으로 한 그람양성균에 한정되는 것으로 알려져 있으나, 다양한 종류의 그람음성 병원성균(e.g. Salmonella typhimurium, E. coli, Cronobacter sakazakii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa)에도 효과를 나타내는 유용미생물 생산 박테리오신에 대한 연구가 활발히 수행되고 있으며, 정제된 박테리오신의 안정성과 기작 구명을 통해 그 활용 범위를 넓히고자 하는 노력이 지속되고 있다(Hassan et al., 2020; Xin et al., 2014; Ye et al., 2021).
한편 유산균에 의하여 생산되는 유기산의 경우 pH 저하뿐만 아니라, 해당 물질의 구조적 특성에 기인한 항균 기작이 기 보고된 바 있으므로, 유용미생물의 배양 조건에 따른 대사산물(산) 생산 특성 및 제어 대상균과의 상호작용에 대한 분석은 유기산의 pH-비의존적 기작에 대한 이해를 확장하는 것에 기여할 수 있다. Neal- McKinney 등(2012)의 연구에서는 다양한 Lactobacillus 균종(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus helveticus)에 속하는 균주로부터 생산된 젖산의 Campylobacter jejuni 균주의 세포막 파괴 기반 생장 억제 효과를 보고한 바 있다.
분석 연구의 대상(미생물, CFS, 유효성분 등)과는 관계없이 유용미생물의 항균능을 검증하는 다수의 연구에서는 선별된 균주의 장 건강 개선용 또는 미생물공학적으로 활용 가능한 산업용 우량균주로서의 기능을 검증하는 연구가 동반된다는 특징이 있다. 유용미생물이 섭취를 전제로 한 장 건강 개선 목적으로 활용되기 위해서는 장내 환경에 대한 저항성 및 생존능을 확보하고 있어야 하며(Jawan 등, 2019), 높은 장세포 부착능(Davoodabadi et al., 2015)과 함께 항생제 내성과 용혈성 및 병원성(virulence)으로 대표되는 잠재적 · 직접적 위해성에 대한 검증이 요구된다(Georgieva et al., 2015). 한편 유용미생물 균주를 대상으로 한 탄소원 발효특성, 다당류 및 단백질 가수분해능 등의 생화학적 특성 분석은 산업적으로 활용할 수 있는 발효균주로서의 기능성 및 적용성 검증의 근거로 활용될 수 있다(Goh et al., 2021).
유용미생물에 의해서 발효된 식품으로부터 추출한 항균성분의 효능을 분석한 연구의 대표적인 사례는 Table 2에 나타난 바와 같다. 치즈 제조 시 프로바이오틱스 균주를 활용함으로써 수용성 추출물(water-soluble extract, WSE)의 항균력을 향상시킬 수 있었으며, 발효 과정 중 유용미생물의 단백질 분해효소에 의해 원료가 분해되어 생산된 펩타이드가 항균력 증진에 기여했을 것이라 추정하였다(Mushtaq et al., 2019). 무지방 우유를 원료로 한 발효유의 경우 무세포유청(Cell-free whey; CFW)의 식중독 원인균 생장 저해 효과가 보고되었으며, 효능이 나타난 균주의 CFS에 의한 효과와 비교하였을 때 상이한 결과를 나타내 발효유 내 다양한 항균 기능성 물질이 발효산물로서 생산되었음을 시사하였다(Georgieva et al., 2015). 한편 Hashemi 등(2017a) 및 Jiang 등(2016)의 연구에서도 알로에나 레몬 주스 등 식품의 발효를 통해 CFS의 항균력이 향상된 결과를 보고하였으며, 특정 식품의 항균능을 향상시키는 목적으로 유용미생물이 활용될 수 있음을 입증하였다. 다만 식품 발효물의 경우, 원료가 되는 기질의 성분에 따라 다양한 대사산물이 생산될 수는 있으나, Hashemi 등(2017b)의 연구를 통해 보고된 바와 같이 그람음성균보다 그람양성균에서 유용미생물 식품 발효물의 효능이 높게 나타나는 현상은 CFS를 이용한 일반적인 연구 결과들과 유사하게 박테리오신이 주요 항균물질임을 시사하며, 이에 항균 스펙트럼 확장을 위한 전략 마련이 필요할 것으로 판단된다.
프로바이오틱스를 대상으로 한 유전체 분석 연구는 다음과 같은 유형으로 구분될 수 있다: 1) 특정 균주의 전장유전체 서열 분석 결과 보고 · 공유, 2) 유전체 분석 기반 구축 및 개선, 3) 유용미생물로서의 기능성 검증, 4) 유용미생물로서의 안전성 검증, 5) 산업적 이용을 위한 우량균주로서의 활용성 검증, 6) 유전자 편집 기반의 균주 기능성 · 활용성 개선.
NGS 등 생물정보 분석 기술의 발달로 2000년대 이후 다양한 미생물에 대한 유전체 서열 분석 사례(draft and/or complete genome)가 지속적으로 보고되었으며(Boetzer and Pirovano, 2014; Cho et al., 2019; Salzberg, 2019; Thakur et al., 2016), 특히 의학적 · 산업적 중요도가 높은 유용미생물의 경우 다양한 균종에 해당하는 균주에 대한 연구가 수행되었다: Bifidobacterium sp.(Sun et al., 2010; Yu et al., 2013), Lactobacillus sp.(Falentin et al., 2010; Pridmore et al., 2004; Wang et al., 2011), Escherichia sp.(Grozdanov et al., 2004; Reister et al., 2014), Enterococcus sp.(Fritzenwanker et al., 2013; Karaseva et al., 2016), Pediococcus sp. (Barreau et al., 2012; Kim et al., 2017). 특히 연구 초기에는 주로 draft genome sequence가 보고되었으나, 상용 유용미생물 균주의 경우 상업적으로 활용을 위해서는 유전체 내 존재하는 안전성 관련 유전자의 유무에 대한 철저한 검증이 요구되기 때문에 complete genome sequence의 분석 필요성이 강조되어 왔다(Falentin et al., 2010; Mazé et al., 2010; Zhang et al., 2009).
Genome 분석의 정확도 및 효율성을 증대시키기 위한 연구의 경우 대표적인 생물정보 데이터베이스(e.g. NCBI Genback) 내 기 보고된 정보의 수정 · 보완이나 유전체 정보의 해석에 활용될 수 있는 기반 정보의 확장을 그 목적으로 한다. 새로운 기술(e.g. Solexa technology)을 이용한 유전체 재분석(resequencing, reannotation) 연구는 기존 결과 간 비교를 통해 기 보고된 유전체 정보를 수정 · 보완함으로써 유전체 내 대표 기능 · 조절 유전자의 유형 및 분포에 대한 이해를 확장하고 있다(Siezen et al., 2012). 한편 주요 프로바이오틱스 속(e.g. Bifidobacterium, Lactobacillus)의 유사 유전자군 분석(Orthologous gene cluster analysis) 결과는 균주 또는 균종별 범유전체(pan-genome) 및 핵심유전체(core genome) 정보를 제공함으로써 유전체 라이브러리 구축에 기여하고 있다(Satti et al., 2018).
유용미생물의 기능성을 중심으로 한 유전체 연구는 장 환경에 대한 저항성 및 생존능(e.g. ATP synthesis for pH homeostasis, acid-tolerance, bile-tolerance, ADI pathway for the neutralization of bacterial internal pH), 장세포 부착능(e.g. the ability for the adhesion and aggregation of probiotics strains at the surface of epithelial cells), 숙주의 영양 환경에 대한 적응력(e.g. the utilization of wide-range of carbohydrates and proteins), 숙주가 섭취할 수 있는 항생제에 대한 저항성(e.g. antibiotic-tolerance), 장관계 감염성 유해미생물에 대한 경쟁 능력(e.g. competitive exclusion of enteropathogenic bacteria) 등 유용미생물이 안정적으로 기능성을 나타낼 수 있도록 하는 단백질 발현 유전자의 유전체 내 존재 여부 및 분포 특성을 분석하는 연구가 보고되어 왔다(Kapse et al., 2019; Khatri et al., 2019; Seddik et al., 2017). 한편 비교유전체 분석(comparative genome analysis)의 경우 인간 모유 올리고당(human milk oligosaccharides; HMOs)의 대사 패턴에 대한 심층 분석 등 특정 영양성분의 균주별 활용 특성 차이의 원인을 균주 간 유전체 구조를 기반으로 제시하여 기능성이 우수한 유용미생물의 발굴에 활용할 수 있도록 한다(Duar et al., 2020).
섭취가 가능한 유용미생물은 반드시 안전성에 대한 검증이 완료되어야 하며, 유전체 분석을 기반으로 한 위해요인별 유전자 유무 분석 방식이 국내외 식품 및 미생물 안전관리 유관기관으로부터 제공되는 공인 시험 절차 · 조건으로서 일반적으로 시행되고 있다(Kwon et al., 2021). 대표적으로 독성인자(virulence factors), 항생제 내성(antibiotic resistance), 유해 대사산물 생산(e.g. biogenic amines)과 관련된 단백질 합성 유전자의 스크리닝 방식이 이용된다(Alayande et al., 2020; Salvetti et al., 2016). 또한 유전체 내 항생제 내성 관련 유전자(e.g. mutations, genomic islands, mobile genetic elements) 등 위해요소의 유용미생물 균주별 분포 특성을 상호 비교 분석하거나, 유전형-표현형 간 비교를 통해 유전체 내 존재하는 유전자의 발현 특성을 고찰함으로써 실질적인 위해도를 예측하는 연구가 수행되고 있다(Rozman et al., 2020; Salvetti et al., 2021).
미생물유래소재 생산원으로 사용되는 산업적 유용미생물의 경우, 유전체 내 해당 소재와 연계된 대사 경로에 포함되는 기능유전자의 분포 특성을 기반으로 우량균주로서의 활용성 검증이 가능하다(Kleerebezem et al., 2003). 일반적으로 발효용 기질의 종류별로 확보 가능한 대사산물의 종류와 양, 대사 패턴은 균주특이적으로 나타나기 때문에 다양한 균주 간 대사 관련 생리 · 생화학적 특성 및 비교유전체 분석을 통해 우량균주를 선별하는 방식의 연구가 수행되어 왔다(Molenaar et al., 2005; Siezen and van Hylckama Vlieg, 2011). 또한 유전체 분석은 특정 대사와 관련된 기능유전자 및 조절유전자에 대한 정보를 종합적으로 제공하기 때문에, 대사 모델의 설계를 기반으로 산업적 미생물유래소재 생산 과정에서 바이오매스(biomass) 생산 효율성의 최적화를 위한 발효 디자인 설계가 가능한 것으로 알려져 있다(Teusink et al., 2006).
유전체 서열 분석은 일반적으로 분석 대상 균주가 현재 보유하고 있는 유전자들에 대한 정보를 제공하기 때문에 해당 균주의 대사 · 생장 등 자연적인 생활사를 이해하기 위한 목적으로 활용되나, 최근에는 유전체 정보를 통해 파악한 유용미생물 균주의 한계를 극복하기 위한 유전자 편집 기술의 이용 및 우량균주의 기능성 · 적용성 개선 우수사례가 보고되고 있어 유전체 정보의 활용 관련 연구 분야를 새롭게 개척하고 있다(Van Pijkeren and Barrangou, 2017).
유전체 분석 연구가 대중적으로 수행되던 2010년 전후 유용미생물이 보유한 항균 물질 생산 유전자의 분석은 전장유전체 내 박테리오신 등 항균 유효성분과 관련된 단백질 발현 유전자의 주석(annotation) 분석 결과를 단순 보고하는 방식으로 진행되었다(Camargo et al., 2018a; Morita et al., 2009). 이후 유전자 서열분석 기술의 발전과 유용미생물의 항균능에 대한 관심이 증대되었으며, 항균 유효성분을 생산할 수 있는 유용미생물과 관련된 최근 유전체 연구 현황 파악을 위한 대표적인 연구 사례는 Table 3에 정리된 바와 같다.
Category | Probiotics strain1) | Accession number | Major annotation tools | Reference |
---|---|---|---|---|
General annotation reports of antimicrobial proteins from genome sequences | Lactobacillus paracasei DTA93 | VTYT00000000 | RAST | Tarrah et al. (2020) |
Lactobacillus plantarum LZ206 | CP015966 | NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | Li et al. (2016) | |
Bacillus clausii ENTPro | CP012475 | RAST | Khatri et al. (2019) | |
Functional annotation specialized for antimicrobial proteins | Lactobacillus acidophilus LA1 | CP017062 | BAGEL | Chung et al. (2018) |
Enterococcus durans OSY-EGY | GCA_004330425.1 | antiSMASH, BAGEL | Hussein et al. (2020) | |
Lactobacillus pentosus SLC13 | CP021675 | BACTIBASE, BAGEL, RAST | Huang et al. (2018) | |
L. plantarum EM | CP037429.1 | BAGEL, BLASTP, RAST | Kim et al. (2020) | |
Pediococcus acidilactici HN9 | CP061715 | BAGEL, BLASTX | Surachat et al. (2020) | |
P. acidilactici ATCC 8042 | CP033438 | RAST, Prokka, HyPe | Cho et al. (2019) | |
Assessment of the antibacterial effects followed by the general annotation reports of antimicrobial proteins | Lactobacillus taiwanensis CLG01 | CP059276 | NCBI non-redundant database | Li et al. (2021) |
L. paracasei ZFM54 | CP032637.1 | NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | Qureshi et al. (2020) | |
Assessment of the antibacterial effects followed by the functional annotation specialized for antimicrobial proteins | Lactobacillus fermentum SK152 | PRJNA318540 | BAGEL, BLASTP | Yoo et al. (2017) |
L. pentosus DZ35 | VUBB00000000 | BAGEL, RAST | Yi et al. (2020a) | |
Lactiplantibacillus plantarum R23 | – 3) | BACTIBASE, BAGEL | Barbosa et al. (2021) | |
Genome and metabolites analysis for the purification of antimicrobial proteins | L. pentosus MS031 | CP043671 | BAGEL, RAST | Yi et al. (2020b) |
Comparative genomics of antimicrobial proteins | P. acidilactici strains (n = 41)2) | – 2), 3) | BAGEL, BLASTP | Li et al. (2021) |
Comparative genomics and characterization of antimicrobial potential based on phenotype-genotype relationship | Bifidobacterium sp. (n = 12), Lactobacillus sp. (n = 46)2) | – 2), 3) | BACTIBASE, BAGEL | Darvishi et al. (2021) |
1) Strain name (including the nomenclature of genus and species of that strain) used in the cited article was indicated.
대부분의 유전자 발굴에 공통적으로 적용 가능한 일반적 유전체 분석 도구(annotation tool)를 활용하여 박테리오신을 포함한 항균성분의 생산 · 조절 관련 유전자를 확인하는 연구는 꾸준히 보고되고 있으며, 특히 다수의 균주가 보유한 유전자와 균주특이적으로 나타나는 유전자의 분포 특성에 대한 비교 연구가 수행되었다(Li et al., 2016; Tarrah et al., 2020; van den Nieuwboer et al., 2016). 단일 균주의 유전체 내에도 다양한 종류의 박테리오신과 연계된 유전자가 존재할 수 있으며, 유전자 분포를 통해 생산 가능성이 확인된 박테리오신의 종류 · 유형에 따라 생장을 제어할 수 있는 미생물 균종 및 항균능을 나타내기 위해 요구되는 환경 조건을 추정할 수 있어 유전체 정보가 해당 균주를 항균물질 생산원으로서 활용하기 위한 전략을 구축하는 기반으로 활용되고 있다(Khatri et al., 2019).
한편 일반적 유전체 분석 도구(annotation tool)와 더불어 박테리오신 등 특정 항균성분과 관련된 유전자와 해당 유전자에 의해 발현되어 생산될 수 있는 단백질의 분석에 특화된 별도의 분석 도구가 이용되고 있으며, 주로 박테리오신에 특화된 데이터베이스(e.g. BAGEL)를 통해 주요 분석 대상 기능유전자뿐만 아니라 관련성이 있는 기타 유전자에 대한 보다 구체적인 정보를 확보할 수 있다(Chung et al., 2018; Hussein et al., 2020). 이처럼 유전체 해석에 다양한 소프트웨어 및 데이터베이스를 이용할 경우, 해당 분석 도구의 적용 시 확보되는 각 결과물 간의 상호 비교를 통해 정확도 높은 항균성분 관련 유전자 분포 정보를 얻을 수 있음이 입증된 바 있다(Huang et al., 2018). 이와 같은 연구는 박테리오신 생산을 직접적으로 담당하는 유전자뿐만 아니라, 핵심 기능유전자 주변에 존재하는 개방형 해독틀(Open reading frame, ORF)의 효율적이고 정확한 분석에 기여하며, 타 균주와의 계통학적인 연관성이나 박테리오신 관련 유전자 클러스터(gene cluster) 보유 특성을 비교함으로써 분석 대상 세균이 특이적으로 보유한 내재적 특성을 파악할 수 있다(Kim et al., 2020; Surachat et al., 2020). 유용미생물의 경우 주로 박테리오신과 관련된 연구가 보고되고 있으나, 그 외에도 peptidoglycan hydrolase 등 항균 유효성분별로 특화된 유전체 분석 소프트웨어 및 데이터베이스가 제공되고 있다(Cho et al., 2019).
유용미생물 균주의 병원성균을 대상으로 한 실질적인 항균 효과를 분석하는 연구를 항균 유효성분 관련 기능 · 조절유전자(e.g. gene cluster, bacteriocin immunity proteins, bacteriocin secretion accessory proteins) 중심의 유전체 분석과 함께 수행할 경우 항균 효능이 높은 균주의 유전형을 결정하거나 제어 대상균의 생장 저해능 기작의 파악이 가능하다(Li et al., 2021; Qureshi et al., 2020).
특히 실험적으로 관찰 및 증명 가능한 제어 가능한 항균 스펙트럼 및 효능 수준으로 대표될 수 있는 표현형적 특성 분석과 박테리오신 관련 유전자에 특화된 유전체 분석 도구(annotation tool)가 연구에 활용될 경우 유용미생물의 항균 특성에 대한 종합적인 이해가 가능할 것으로 기대된다(Barbosa et al., 2021). 특히 단일 연구에서 항균능을 기준으로 효능이 높은 균주를 스크리닝 및 분리하는 과정을 수행한 뒤 해당 우량균주를 대상으로 한 유전체 분석이 연속적으로 수행되는 연구 또한 다수 보고되고 있으며, 항균능 관련 유전자의 분포는 각 균주가 나타내는 특이적인 효과 스펙트럼이나 제어능 수준에 대한 기작 구명 근거로 활용될 수 있다(Yi et al., 2020a; Yoo et al., 2017). 더욱이 단일 연구 내에서 유용미생물의 항균능 평가와 유전체 분석뿐만 아니라 최종적으로 신규 발굴된 항균 유효성분의 분리 · 정제까지 수행하는 경우도 보고되고 있으며, 이러한 연구는 유용성분의 소재화 가능성을 종합적으로 파악할 수 있다는 측면에 있어 강점이 있다(Yi et al., 2020b).
한편 다수의 균주로부터 확보한 유전체 정보로 수행되는 비교유전체 분석(comparative genome analysis)의 경우 유용미생물 균주별 표현형적 · 유전학적 구분을 위한 기초 자료를 제공한다. 동 유용미생물 균종을 구성하는 균주 간 항균능 중심의 비교유전체 분석을 수행한 Li 등(2021)의 연구에 따르면 단일 균주 유전체 분석은 박테리오신 특화 데이터베이스 기반 오페론 분석과 함께 단백질 구조 및 도메인 분석을 통해 박테리오신의 유형별 구조 및 특성에 대한 추정을 가능하게 하며, 균주별 유전체 간 비교를 통해서는 진화론적 관계성 분석이나 균주 간 공통적으로 나타나는 구조적 특성을 파악하는데 기여한다.
다만, 비교유전체 분석과 실질적 항균 효능 시험을 동시에 진행함으로써 항균능 관련 표현형과 유전형 간의 관계성(genotype- phenotype relationship)을 분석한 Darvishi 등(2021)의 연구에서는 균주별로 보유하고 있는 항균성분 관련 기능유전자의 개수나 종류와 실질적인 항균 효능 간 연관성이 없는 경우(예: 박테리오신 관련 유전자를 적게 보유하고 있는 균주가 해당 유전자 또는 유사한 기능성의 유전자를 다양하게 또는 많이 보유하고 있는 균주보다 실질적인 병원성균 생장 저해능이 높은 경우)가 존재하므로 항균능 평가를 위한 유전체 연구는 표현형적 특징에 대한 검증을 함께 수행해야 한다는 점을 강조하였다.
결 론
유용미생물이 생산하는 항균성분과 관련된 연구는 지속적으로 보고되고 있으나 식중독균의 경우 다수의 연구에서 제한적 스펙트럼 및 생장 제어 수준의 효과가 주로 보고되고 있기 때문에 실질적인 적용 과정에서는 항균능을 향상시킬 수 있는 효율적 전략이 필요할 것으로 보인다. 특히 유용미생물-식중독균 간 동시 배양 방식 및 CFS를 통해 효능이 확인된 사례에 대하여 대사산물 내 실질적인 유효성분을 발굴하기 위한 정제 연구가 수행될 필요가 있다. 한편 유용미생물 유래 박테리오신의 경우 L. monocytogenes 등 제한된 균종에 대한 제어능이 주로 보고되고 있으므로, 식품 발효물 등 다양한 균종을 대상으로 광범위한 효능이 나타났던 사례를 중심으로 신규 항균활성소재를 발굴하고자 하는 연구가 요구되며 타 화학적 · 물리적 살균기술 간 조합처리 등을 통한 기존 물질의 효능 보완 전략 도입이 필요하다. 유전체 분석의 경우 최근의 프로바이오틱스 대상 연구 현황을 통해 파악된 바와 같이 기존에 보고된 생물정보의 보완을 통한 신규 정보 발굴이나 특화된 유전자 정보 분석 도구의 적극적인 도입을 통한 항균 스펙트럼 및 항균능 · 분석능 향상을 중심으로 한 연구가 지속적으로 수행되어야 한다. 다만 유전체 생물정보를 통해서 파악할 수 있는 유용미생물의 항균유효성분 생산에 대한 잠재력과는 관계없이, 높은 항균 효과를 확보하기 위해서는 유전자의 실질적인 발현과 합성된 단백질의 활성에 최적화된 환경이 조성되어야 하므로 유전체-전사체-단백체의 종합적 분석과 in vitro 방식의 살균력 · 보존력 검증 시험 등이 유전체 분석 연구와 함께 수행되어야 할 것으로 판단된다.