α-Amylase와 Protease 효소 활성을 가진 Bacillus subtilis 균주를 이용한 기능성 소재 개발

B. subtilis MGE 2012 균주는 선행연구에서 메주로부터 분리되었으며 이를 효소활성 발효물 제조를 위한 종균으로 사용하였다. 비피도박테리아 증식능 확인을 위하여 Bifidobacterium lactis BL750 균주(Culture Systems Inc., Mishawaka, IN, USA)와 Bifidobacterium breve KCTC 3220 균주를 사용하였다. B. subtilis MGE 2012 균주는 Nutrient 배지(BD, Sparks, MD, USA)를 이용하여 배양하였고, 비피도박테리아 균주들은 Reinforced Clostridial Medium (RCM) 배지(BD, Sparks, MD, USA)를 사용하여 혐기 챔버 (DG250; Don Whitley Scientific Ltd., Bingley, UK)에서 배양하였다.

효소활성 측정을 위하여 Nutrient agar (BD, Sparks, MD, USA)에 starch (Showa Chemicals Inc., Osaka, Japan)와 skim milk (BD, Sparks, MD, USA)를 첨가하여 배지를 제조하였다.즉, Nutrient agar에 starch (1%, w/v)와 skim milk (10%, w/v)를 각각 첨가한 후 α-amylase와 protease 활성 측정을 위한 배지로 사용하였다. 제조된 고체배지에 하룻밤 배양한 B. subtilis MGE 2012 균주 배양액 1 uL를 점적한 후 37℃에서 7시간 동안 배양한 후, 균체 주변의 환을 통해 protease 활성을 측정하였고 α-amylase 활성의 경우 배지 위에 iodine 용액((주)동성상사, 서울, 대한민국) 2 mL를 골고루 뿌려 염색되지 않는 투명환 생성 여부로 판단하였다.

현미 분말, 대두 분말, 쌀 단백 분말은 ㈜제이케이뉴트라(수원, 대한민국)에서 제공받아 사용하였다. 세 가지의 곡물을 단독 혹은 복합[현미와 대두 분말(1:1), 현미와 쌀 단백 분말(1:1)]으로 사용하여 곡물 기질을 조제하였으며 기질 총 중량 5g에 최종 수분 함량이 60%가 되도록 멸균수를 첨가한 후 증숙(121℃, 15분)하였다. 이후 멸균수로 2회 세척한 B. subtilis MGE 2012 균주(약 10⁹ CFU/mL)를 0.5% 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 0시간과 24시간째에 0.4g의 시료를 취해 멸균수 1.2 mL에 현탁하여 원심분리(14,000rpm, 4분) 후 상등액을 멤브레인 필터(AnyLab Co., Seoul, Korea)로 2회 여과(0.45um 필터 1회, 0.22 um 필터 1회)하였다. 여과액 1uL를 상기의 효소활성 측정을 위한 배지에 점적하여 활성 유무를 판단하였다.

항산화능 측정은 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (Roche, Mannheim, Germany) 라디칼을 이용한 분석법으로 실시하였다. 즉, 7 mM의 ABTS와 2.45 mM potassium persulfate (Daejung chemicals, Siheung, Korea)를 1:1 비율로 혼합한 다음 24시간 암반응시켜 반응액을 제조하였으며, 제조된 반응액은 OD₇₃₄ 에서 흡광도가 0.7±0.02 부근이 되도록 희석하였다. 이후 상기의 방법으로 제조된 여과된 복합기질(현미 분말과 대두 분말) 발효물(4 uL)과 희석 반응액(196 uL)을 혼합하여 암반응 20분 진행 후 OD₇₃₄에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성 유무를 판단하였다. 항산화 활성의 정량적 분석을 위하여 (+)-sodium L-ascorbate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준곡선 작성을 위한 표준물질로 사용하였고 정량값은 Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC; mg eq. AA / 100 mg) 값으로 나타내었다.

상대적으로 효소활성이 우수한 복합기질(현미 분말과 대두 분말 혼합)의 배양물(37℃, 48시간 배양) 500 uL를 동결건조 후 멸균수 60 uL에 현탁하였다. 현탁액 20 uL를 5 mL RCM broth (배지 성분 1/10 포함)에 넣고 B. lactis BL750과 B. breve KCTC 3220 균주를 각각 1% 접종하였다. 이를 37℃에서 혐기 배양하면서 경시적으로(0, 6, 12시간) 생균수를 측정하여 비피도박테리아 증식 유무를 판단하였다.

본 논문에 기술된 결과 값은 3반복 실험 결과의 평균 및 표준편차로 나타냈고 유의성 검증을 위해 SPSS ver. 25 (SPSS Inc., Chicago, IL) 프로그램을 사용하였다. 독립표본 t검정으로 유의성을 검정하고 Levene의 등분산 검정을 통해 평균의 동일성에 대한 t-검정으로 p<0.05 수준에서 사후 검정하였다.

실험방법에서 언급한 α-amylase 및 protease 활성 확인용 고체배지에 B. subtilis MGE 2012 균주 배양액 1 uL 점적한 후 배양한 결과, 균체 주변에서 효소 활성 투명환이 관찰되었다 (Fig. 1). 이는 B. subtilis MGE 2012 균주가 α-amylase 및 protease를 동시에 효율적으로 생산하고 있음을 의미한다. 일반적으로 B. subtilis 균종은 α-amylase (glycogenase; EC 3.2.1.1)를 생산하는데 이는 전분의 한 종류인 amylose를 가수분해하여 maltotriose와 maltose를 생성하며 전분의 또 다른 종류인 amylopectin을 가수분해하여 glucose와 dextrin을 생성한다(Raul et al., 2014). 또한, protease는 단백질의 펩타이드 결합을 가수분해하여 아미노산을 생성한다(Harwood and Kikuchi, 2022).

Fig. 1. Enzyme activity of Bacillus subtilis MGE 2012 strain on nutrient agar supplemented with starch (for α-amylase) and skim milk (for protease).

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B. subtilis MGE 2012 균주의 곡물 기질에 따른 효소활성을 비교하기 위하여 현미 분말, 대두 분말, 쌀 단백 분말을 단독 혹은 복합(현미와 대두 분말, 현미와 쌀 단백 분말)으로 사용한 결과, α-amylase의 경우 현미 분말과 대두 분말 복합기질에서 24시간 배양 후 가장 높은 효소활성을 나타냈고(Fig. 2A), protease의 경우에도 24시간 배양 후 현미 분말과 대두 분말 복합기질에서 가장 높은 효소활성이 확인되었다(Fig. 2B). 이는 상대적으로 전분질이 풍부한 현미 분말과 단백질이 풍부한 대두 분말의 조합이 B. subtilis MGE 2012 균주의 α-amylase 및 protease 유전자의 발현을 유도한 것으로 추론되었다. 본 연구그룹에서 수행한 선행연구에서 Bacillus licheniformis 1-B-12 균주의 경우 현미 분말(50%), 미강 분말(30%) 및 대두 분말(20%) 복합기질에서 가장 우수한 효소활성이 관찰되었다(Kang and Moon, 2016). 따라서 사용하는 균주에 따라 최적의 기질 조합을 선정함으로써 효율적인 효소식품의 소재 생산이 가능할 것으로 판단된다.

Fig. 2. Enzyme activity of fermentations by Bacillus subtilis MGE 2012 with different substrate compositions. A, α-amylase; B, protease activity. BR, brown rice powder; S, soybean powder; RP, rice protein powder.

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B. subtilis MGE 2012 균주를 적용한 복합기질(현미 분말과 대두 분말) 발효물의 ABTS radical 소거능을 확인한 결과, 0시간째 시료의 경우 19.82 AEAC (mg eq. AA / 100 mg)를 나타낸 반면, 24 시간 발효 후에는 35.08 AEAC (mg eq. AA / 100 mg)로 나타나 발효 전·후 항산화능이 약 1.77배 증가하였다 (Fig. 3). 이는 복합기질에 적용된 B. subtilis MGE 2012 균주의 발효과정에서 단백질 분해 산물 및 다양한 대사산물이 생산되어 항산화 활성에 기여했을 것으로 추론된다.

Fig. 3. ABTS radical scavenging activity of fermentation by Bacillus subtilis MGE 2012 in a mixture of brown rice powder and soybean powder. ***p<0.001 vs. control (0 h).

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효소활성 발효물의 비피도박테리아 증식능을 확인하기 위하여 B. lactis BL750과 B. breve KCTC 3220 균주를 대상으로 시험한 결과, B. lactis BL750 균주의 경우 대조군은 5.25 log CFU/mL로 시작해 6, 12시간째 각각 5.67, 5.91 log CFU/mL로 증가한 반면 효소활성 발효물은 5.38 log CFU/mL로 시작해 6, 12시간째 각각 6.38, 6.87 log CFU/mL로 증가하여 대조군 대비 6, 12시간째 각각 0.71, 0.96 log CFU/mL의 차이를 보였다(Fig. 4A). B. breve KCTC 3220 균주의 경우 대조군은 3.23 log CFU/mL로 시작해 6, 12시간째 각각 3.69, 3.43 log CFU/mL로 증가한 반면 효소활성 발효물 첨가군은 3.64 log CFU/mL로 시작해 6, 12시간째 각각 4.57, 6.00 log CFU/mL로 증가하여 대조군 대비 6, 12시간째 각각 0.88, 2.57 log CFU/mL의 차이를 보였다 (Fig. 4B). 이는 B. subtilis MGE 2012 균주가 적용된 복합기질(현미 분말, 대두 분말)의 발효과정에서 생산되는 분해산물과 대사산물이 비피도박테리아의 증식에 기여한 것으로 추론되며 이는 소화효소 활성과 함께 장내 유익균의 증식에도 도움을 줄 수 있는 소재의 개발에 관한 것이어서 그 의의가 크다. 향후 본 연구에서 개발된 소재를 활용한 장 건강 기능성 검증 임상시험이 이루어진다면 건강기능성 소재로서 각광을 받을 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 4. Bifidogenic growth stimulation activity of fermentation by Bacillus subtilis MGE 2012 in a mixture of brown rice powder and soybean powder. A, Bifidobacterium lactis BL750; B, Bifidobacterium breve KCTC 3220. **p<0.005 vs. control; *** p<0.001 vs. control.

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현대인들의 식습관 및 생활환경의 변화는 건강상 부정적인 영향을 초래하고 이는 사회적 부담으로 작용한다. 이러한 건강상의 문제를 해결하기 위하여 다양한 방법이 고려될 수 있겠지만 평소 건강기능성 식품을 꾸준히 섭취하는 것도 한 방법일 것이다. 특히, 중·장년층의 경우 소화효소 활성 저하 및 장내 마이크로바이옴의 변화로 인한 장내 건강이 나빠지는 것이 일반적이며 이를 개선하기 위한 많은 소재들이 연구 개발되고 있다(Eun, 2013; Jeong et al., 2022). 본 연구에서 개발된 소재 또한 동일한 목적에 활용될 수 있을 것이다.